ДНК секвенирането е процес на определяне на реда на нуклеотидите (аденин, тимин, цитозин и гуанин) в ДНК молекула. Има няколко метода за секвениране на ДНК и може да се категоризира като традиционно секвениране, секвениране на целия геном (WGS) и генотипиране.
Тук ще разгледаме в детайли всеки един от тях:
Секвениране от първо поколение (Традиционно секвениране)
Секвениране на Sanger
Този метод, разработен от Frederick Sanger, е първата широко използвана техника за секвениране на ДНК.
Този метод разчита на прекратяването на синтеза на ДНК с помощта на нуклеотиди, завършващи веригата. Фрагменти от ДНК се синтезират в присъствието на модифицирани нуклеотиди, които прекъсват удължаването на ДНК веригата. Тези терминирани фрагменти се разделят по размер с помощта на гел електрофореза, разкривайки ДНК последователността.
- Основно се използва за целенасочено секвениране на специфични региони на интерес.
- Често се използва за целенасочени изследвания или валидиране на специфични генетични региони.
- Методът е надежден за точно секвениране на отделни ДНК фрагменти.
Като резултат от този метод се генерират последователности за специфични ДНК фрагменти.
Секвениране на Максам-Гилбърт
Методът е разработен приблизително по същото време като секвенирането на Sanger, този метод включва химическо разцепване на ДНК на специфични бази.
При него ДНК е химически модифицирана на специфични бази и последващото разцепване на тези модифицирани бази генерира фрагменти с определени крайни точки.
- Използва се за секвениране на по-къси ДНК фрагменти, но е по-малко разпространено в сравнение със секвенирането на Sanger.
Следващо поколение секвениране (NGS)
Следващото поколение секвениране (NGS), известно още като високопроизводително секвениране, е революционна технология, която позволява бързото и паралелно секвениране на милиони ДНК фрагменти едновременно. То се различава от традиционните методи за секвениране на ДНК, като секвенирането на Sanger, което е по-бавно и по-трудоемко. NGS трансформира геномните изследвания, клиничната диагностика и персонализираната медицина, като предоставя бързи, рентабилни и масови паралелни възможности за секвениране на ДНК.
Секвениране на целия геном (WGS)
Това включва секвениране на целия геном, предоставяйки цялостен анализ на генетична информация. WGS може да идентифицира вариации както в кодиращи, така и в некодиращи области на генома.
WGS често се извършва с помощта на NGS технологии, като секвениране на Illumina, които позволяват високопроизводително секвениране на милиони ДНК фрагменти едновременно.
- Прилага се в изследвания, клинична диагностика и персонализирана медицина за широко разбиране на генетичния профил на индивида.
Секвениране на целия екзом (WES)
Това е вид технология за секвениране от следващо поколение (NGS), която се фокусира върху секвенирането на екзома – протеин-кодиращите региони на гените – вместо секвениране на целия геном. Екзомът представлява само малка част от общата геномна ДНК, но съдържа повечето известни варианти, свързани с дадена болест. WES се счита за по-рентабилен от секвенирането на целия геном, тъй като селективно улавя и секвенира екзоничните региони, намалявайки количеството данни, които трябва да бъдат обработени.
- Обикновено се използва в клинични условия за идентифициране на генетични варианти, свързани с наследствени заболявания. Той е особено полезен за диагностициране на редки генетични заболявания или случаи, при които основната генетична причина е неизвестна.
Целенасочено секвениране
Целенасоченото секвениране, форма на секвениране от следващо поколение (NGS), е мощен и рентабилен подход, който се фокусира върху секвенирането на специфични региони на генома, а не върху целия геном. Този метод позволява на изследователите да селективно секвенират региони от интерес, като специфични гени или геномни региони, свързани с определени заболявания.
Приложения:
- Изследване на болести: Изследва специфични генетични вариации, свързани с болести.
- Геномика на рака: Идентифицира мутации в гени, свързани с рака, за персонализирани стратегии за лечение.
- Наследствени заболявания: Помага при идентифицирането на мутации, отговорни за генетични нарушения.
- Популационни изследвания: Изследва специфични геномни региони в големи популации за научни изследвания или клинични приложения.
Други видове NGS секвениране
Освен методите, които разгледахме в детайли, секвенирането от ново поколение включва също и:
Секвениране на РНК (RNA-Seq), ChIP-Seq (хроматиново имунопреципитационно секвениране), Methyl-Seq (метиломно секвениране), Метагеномно секвениране. Едноклетъчно секвениране. Секвениране на циркулираща ДНК
Повече детайли за всеки от тези методи очаквайте в следващи статии.
Генотипиране
Това не е метод за секвениране сам по себе си, а изчислителна техника, която оценява липсващи или ненаблюдавани генетични данни въз основа на известни данни. Импутирането може да се приложи към генетични вариации, като единични нуклеотидни полиморфизми (SNP).
- Включва изчислителна оценка на липсващи генетични данни въз основа на съществуваща информация.
- Обикновено се използва в широкомащабни генетични изследвания за увеличаване на данните за генотипа и подобряване на статистическата мощност.
Изходни данни
Както видяхме, различните видове ДНК анализи водят до различни резултати. Ето какво получавате от всяко от тях:
- Традиционно секвениране: Генерира последователности за специфични ДНК фрагменти.
- Секвениране на целия геном: Предоставя информация за целия геном.
- Секвениране на целия екзом: Данните, генерирани от WES, изискват сложен биоинформатичен анализ за точно идентифициране и интерпретиране на генетични варианти. Това включва сравняване на секвенирания екзом с референтен геном, за да се определят точно вариациите.
- Генотипиране: Импутираните данни добавят информация към съществуващите генотипове.
